Mappa proteica risolta spazialmente dei virioni di citomegalovirus umano intatto

Nature Microbiology volume 8, pagine 1732–1747 (2023)Citare questo articolo

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Gli herpesvirus assemblano grandi particelle avvolte che sono difficili da caratterizzare strutturalmente a causa delle loro dimensioni, fragilità e complesso proteoma multistrato con natura parzialmente amorfa. Qui abbiamo utilizzato la spettrometria di massa reticolante e la proteomica quantitativa per derivare una mappa interattomica risolta spazialmente di virioni di citomegalovirus umano intatto. Ciò ha consentito l'allocazione de novo di 32 proteine virali in quattro strati virionici risolti spazialmente, ciascuno organizzato da una proteina d'impalcatura virale dominante. La proteina virale UL32 si impegna con tutti gli strati in un orientamento radiale N-C-terminale, collegando il nucleocapside all'involucro virale. Abbiamo osservato l'incorporazione strato-specifica di 82 proteine ospiti, di cui 39 reclutate selettivamente. Abbiamo scoperto come UL32, mediante il reclutamento della fosfatasi PP-1, antagonizza il legame con le proteine 14-3-3. Questo meccanismo assicura un'efficace biogenesi virale, suggerendo un ruolo perturbante dell'interazione UL32-14-3-3. Infine, abbiamo integrato questi dati in un modello a grana grossa per fornire approfondimenti globali sulla configurazione nativa delle interazioni tra virus e proteine ospiti all'interno degli herpesvirioni.

L'assemblaggio strutturato di particelle infettive, chiamate virioni, è fondamentale per la trasmissione del virus tra cellule e organismi. I virioni contengono il genoma dell'acido nucleico virale racchiuso in un guscio proteico del capside. Un certo numero di proteine co-confezionate facilitano il processo di infezione e l’inizio dell’espressione genica virale. Gli herpesvirus, una famiglia di virus a DNA a doppio filamento, assemblano particelle particolarmente grandi e complesse, che ospitano molte proteine diverse che vengono consegnate alla cellula ospite al momento dell'infezione.

La capacità degli herpesvirioni di incorporare un ampio insieme di proteine è consentita dalla loro tipica architettura multistrato1. L'involucro lipidico esterno ospita varie glicoproteine virali necessarie per il legame con i recettori della cellula ospite e la fusione della membrana2. Lo spazio tra l'involucro e il nucleocapside icosaedrico centrale è riempito da una matrice proteica, il tegumento. Sebbene le singole proteine del tegumento siano state assegnate a distinti sottostrati interni ed esterni sulla base di dati biochimici3 e microscopici4,5, i dettagli dell'organizzazione delle proteine del tegumento non sono compresi. Le particelle di herpesvirus incorporano anche numerose proteine ospiti, ma pochissimi di questi eventi sono stati caratterizzati funzionalmente o meccanicamente6,7.

Recenti studi di microscopia elettronica criogenica (cryoEM) sugli herpesvirioni hanno rivelato sottostrutture del nucleocapside8,9, del portale10,11 e di diversi complessi glicoproteici2,12,13. Inoltre, studi precedenti hanno fornito solo informazioni sulla composizione proteica complessiva degli herpesvirioni, identificando tra 46 e 82 proteine virali14,15,16,17,18. Tuttavia, manca una caratterizzazione sistematica della coordinazione spaziale e delle interazioni del virus e delle proteine ospiti all'interno dei virioni.

Qui utilizziamo la spettrometria di massa con reticolazione (XL-MS) per costruire una mappa di prossimità a livello di virione di 32 proteine virali e 82 proteine ospiti nei virioni extracellulari intatti del citomegalovirus umano (HCMV), il più grande herpesvirus umano. I dati consentono l’assegnazione de novo delle proteine dell’ospite e del virus e delle loro interazioni proteina-proteina (PPI) agli strati virionici, fornendo informazioni sull’organizzazione dei sottostrati del tegumento. Scopriamo che la proteina virale UL32 (nota anche come pp150) agisce come un'impalcatura dominante, si impegna negli IPP attraverso la particella e media il reclutamento delle proteine ospiti, come le proteine 14-3-3 e la proteina fosfatasi 1 (PP-1) . PP-1 antagonizza il legame 14-3-3 con UL32 ed è necessario per l'avvio efficiente dell'espressione genica virale e della produzione della progenie virale. Pertanto, tracciando l'organizzazione del proteoma all'interno degli herpesvirioni nativi, forniamo una base per la comprensione strutturale e funzionale dei PPI cruciali.

0.75 in n = 2 biological replicates) in virions (bottom bar). d,e, Purified virions from recombinant mutant viruses harbouring alanine substitutions in the designated motifs were assessed for protein levels by immunoblotting. Representative experiments of n = 2 biological replicates are shown./p>91% of the protein copies inside a virus particle./p>

10 copies) be identified in both replicates. When a crosslink involved a lower-abundance protein (that is, <10 copies), we required that the crosslink be identified in only one of the replicates. The rationale is that this balances crosslink confidence for highly abundant proteins with sensitivity for low-abundance proteins. Second, PPIs were only reported when there were two unique crosslinks identified, giving a higher-confidence set of PPIs. To retain only host proteins incorporated into the particle, host proteins that did not directly link to viral proteins were removed. The filtered set of crosslinks is available in Supplementary Table 2. The list of the corresponding PPIs together with evidence from existing data is available in Supplementary Table 3. The XL-based PPI network was generated on the basis of interprotein crosslinks from Supplementary Table 2 and visualized using edge-weighted spring-embedded layout70 in Cytoscape v.3.7.2. Edge weighting was based on the number of identified interlinks between protein pairs. Additional crosslink networks between selected proteins were visualized using xiNET71./p>

0.75 were considered (from the Phospho (STY).txt table). The positions of individual phosphosites as identified from this experiment were used to map phosphosites on the UL32 amino acid sequence (Fig. 4c). Phosphosite SILAC ratios were also corrected for the protein-level SILAC ratios (from proteinGroups.txt) as quantified from an analysis of the whole-virion proteome without IMAC enrichment. Phosphosites were excluded when the corresponding phosphopeptide contained residues mutated in the SILK/RVxF motifs of UL32. Then, protein-level corrected phosphosite ratios were averaged (quantification in both replicates required)./p>0.6 were considered./p>

220 nm). These correspond to the median of diameters from the purified sample ± two times the standard deviation. The fraction of particles with diameters that fall below 160 nm, exceed 220 nm or fall in between are indicated for the non-cross-linked (d) or cross-linked (e) sample types. Purification results in more homogeneous particle diameters, enriching virions in the expected size range. Thus, our protocol captures the native configuration of the particles at relatively high sample purity. At least 367 particles were counted per condition./p>