Una pipeline di scoperta di anticorpi bispecifici ad alto rendimento

Biologia delle comunicazioni volume 6, numero articolo: 380 (2023) Citare questo articolo

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Gli anticorpi bispecifici (BsAbs) rappresentano una classe emergente di immunoterapia, ma l’inefficienza dell’attuale scoperta ha limitato la loro ampia disponibilità clinica. Qui riportiamo una pipeline di screening funzionale ad alta produttività, agnostica, basata su singola cellula, che comprende ingegneria molecolare e cellulare per la generazione efficiente di cellule della libreria BsAb, seguita da interrogazione funzionale a livello di singola cellula per identificare e ordinare cloni positivi e sequenza a valle identificazione e caratterizzazione della funzionalità. Utilizzando un impegnatore di cellule T bispecifico CD19xCD3 (BiTE) come modello, dimostriamo che la nostra piattaforma a cellula singola possiede un'elevata efficienza di screening fino a un milione e mezzo di cellule di libreria di varianti per corsa e può isolare cloni funzionali rari a un basso livello abbondanza dello 0,008%. Utilizzando una complessa libreria cellulare che esprime CD19xCD3 BiTE con circa 22.300 varianti uniche comprendenti scFv variati in modo combinatorio, collegamento di linker e orientamenti VL/VH, abbiamo identificato 98 cloni unici, inclusi quelli estremamente rari (~ 0,001% di abbondanza). Abbiamo anche scoperto BiTE che mostrano nuove proprietà e intuizioni per progettare preferenze variabili per la funzionalità. Ci aspettiamo che la nostra piattaforma unicellulare non solo aumenti l’efficienza della scoperta di nuovi immunoterapici, ma consenta anche di identificare principi di progettazione generalizzabili basati su una comprensione approfondita delle interrelazioni tra sequenza, struttura e funzione.

Gli anticorpi bispecifici (BsAbs) rappresentano una classe molto interessante di anticorpi e immunoterapici che hanno un grande potenziale per il trattamento di molti disturbi, tra cui il cancro e l'autoimmunità1,2,3,4,5. Sono prodotti biologici innaturali progettati per riconoscere due diversi epitopi sullo stesso o su antigeni bersaglio diversi. I BsAbs offrono modalità d'azione terapeutiche uniche, come l'attivazione e il coinvolgimento delle cellule immunitarie per uccidere le cellule tumorali e l'azione simultanea su due bersagli terapeutici sinergici5,6,7,8. Pertanto, i BsAb possono presentare vantaggi terapeutici superiori rispetto ai tradizionali anticorpi monoclonali (mAb) rispetto a specificità, efficacia, tossicità e resistenza ai farmaci. I BsAb attivanti le cellule T (TAB) rappresentano la sottoclasse più grande di BsAb e rappresentano oltre il 50% della pipeline preclinica e clinica di BsAb9, tra cui Blinatumomab clinicamente approvato (CD3xCD19), Tebentafusp-tebn (CD3xGP100), Mosunetuzumab (CD3xCD20) e Teclistamab ( CD3xBCMA)9,10. Le TAB possono collegare direttamente le cellule T e le cellule tumorali per ucciderle e hanno un grande potenziale per trattare molti tipi di cancro. Attualmente esistono oltre 45 TAB basati su CD3, tra cui BCMAxCD3, Her2xCD3, CEAxCD3 e PSMAxCD3, in fase di sperimentazione clinica per il trattamento di tumori solidi ed ematologici1,6. I TAB possono essere progettati in diversi formati, inclusi gli attivatori bispecifici delle cellule T (BiTE), che utilizzano frammenti variabili a catena singola collegati in tandem (scFv) che prendono di mira un epitopo delle cellule T e un antigene tumorale e IgG a catena leggera comune con un formato a grandezza naturale configurazione delle immunoglobuline in cui ciascuna catena pesante variabile prende di mira un recettore delle cellule T o un antigene tumorale1,6.

Sfortunatamente, lo sviluppo di BsAbs terapeutici, compresi i TAB, rimane un processo estremamente impegnativo, lento e costoso, che limita la loro disponibilità clinica per un’ampia gamma di malattie. Attribuiamo questo collo di bottiglia in gran parte alla complessità e all'inefficienza degli attuali metodi di scoperta di BsAb. Il flusso di lavoro convenzionale per la scoperta di BsAb inizia comunemente con la caratterizzazione di un pool di leganti mAb per due rispettivi antigeni o epitopi. Quindi un pannello di mAb viene selezionato per ingegnerizzare individualmente le varianti di BsAb unendo due domini leganti l'antigene derivati ​​da ciascun mAb parentale tramite eterodimerizzazione di subunità o fusione genetica diretta (ad esempio BiTE)11,12,13,14,15,16,17, 18,19,20,21,22,23. Quindi un numero limitato di varianti di BsAb viene espresso, purificato e successivamente testato individualmente in un test di legame a doppio target e/o in un test funzionale per identificare i cloni positivi. Da notare che, nonostante la costruzione di BsAb di solito inizi con due leganti antigenici pre-caratterizzati, integrarli per diventare un BsAb funzionale è molto meno semplice. Infatti, l’attività legante di un BsAb ai suoi target è solo un prerequisito, che non sempre si traduce in attività funzionale. Ad esempio, Emicizumab (un BsAb clinicamente approvato per il trattamento dell'emofilia A) è stato scoperto mediante un approccio di "forza bruta" in cui circa 40.000 candidati hanno dovuto essere espressi, caratterizzati e ottimizzati individualmente11. Per i TAB, in particolare, l'attivazione delle cellule T e le funzioni di uccisione del tumore dei BsAb risultanti dipendono in modo cruciale da numerosi fattori, tra cui la posizione dell'epitopo e la distanza dalla membrana cellulare24,25,26,27,28,29, la dimensione e la densità dell'antigene27,28,29 ,30,31,32,33,34,35,36, affinità di legame anticorpo/antigene31,32,33,34,35,37,38 dimensione, valenza, piegatura, orientamento strutturale e meccanica dei BsAbs e lunghezza del linker e flessibilità27,36,39,40,41,42. Sebbene sia ben noto che piccole variazioni nei formati e nelle caratteristiche dei BsAb possono essere determinanti critici della funzionalità, le relazioni tra questi fattori sono complicate e attualmente non esiste un principio di progettazione generale che possa informare la funzione di BsAb. In pratica, quindi, il campo si è basato su un processo di tentativi ed errori in cui i BsAb sono empiricamente progettati e costruiti da leganti mAb esistenti e devono quindi essere valutati individualmente per la loro funzionalità. Questo approccio convenzionale, che in genere prevede una piastra per microtitolazione e un sistema di gestione dei liquidi, è parziale e limita in modo significativo la produttività di scoperta di BsAb, il tasso di successo e il tempo di consegna per identificare un vantaggio terapeutico per un ulteriore sviluppo.