Osservazione diretta degli stati conformazionali di PIEZO1

Natura volume 620, pagine 1117–1125 (2023)Citare questo articolo

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I PIEZO sono canali ionici meccanosensibili che convertono la forza in segnali chemoelettrici1,2 e svolgono ruoli essenziali in diversi contesti fisiologici3. Studi in vitro hanno proposto che i canali PIEZO trasducano la forza meccanica attraverso la deformazione di estese lame di domini transmembrana provenienti da un poro centrale conduttore di ioni4,5,6,7,8. Tuttavia, si sa poco su come questi canali interagiscono con il loro ambiente nativo e su quali movimenti molecolari sono alla base dell'attivazione. Qui osserviamo direttamente la dinamica conformazionale delle lame delle singole molecole PIEZO1 in una cellula utilizzando l'imaging a fluorescenza nanoscopica. Rispetto ai precedenti modelli strutturali di PIEZO1, mostriamo che le lame sono significativamente espanse a riposo dallo stress di flessione esercitato dalla membrana plasmatica. Il grado di espansione varia notevolmente lungo la lunghezza della lama, dove la diminuzione della forza di legame tra i sottodomini può spiegare l'aumento della flessibilità della lama distale. Utilizzando modulatori chimici e meccanici di PIEZO1, mostriamo che l'espansione della lama e l'attivazione del canale sono correlate. I nostri risultati iniziano a scoprire come PIEZO1 viene attivato in un ambiente nativo. Più in generale, poiché rileviamo in modo affidabile spostamenti conformazionali di singoli nanometri da popolazioni di canali, ci aspettiamo che questo approccio serva da quadro per l'analisi strutturale delle proteine ​​di membrana attraverso l'imaging nanoscopico.

La capacità di percepire e trasdurre le informazioni meccaniche provenienti dall'ambiente è fondamentale per un'ampia varietà di processi fisiologici in tutti gli ambiti della vita9. I canali di meccanotrasduzione sfruttano il lavoro meccanico per aprire direttamente un poro che conduce gli ioni in risposta alle perturbazioni nella membrana cellulare, avviando la segnalazione cellulare10. I PIEZO sono una famiglia di canali di meccanotrasduzione presenti negli Eukarya1,2 e mediano una vasta gamma di processi fisiologici nei mammiferi, tra cui la sensazione tattile11, il controllo della pressione sanguigna12, lo sviluppo vascolare13,14, il prurito meccanico15 e lo stato di idratazione degli eritrociti16.

I PIEZO sono grandi proteine ​​di membrana omotrimeriche strutturalmente disposte come un triskelion4,5,7 (Fig. 1a). Ciascun protomero entra in contatto con i domini del poro centrale e del cappuccio vicino al terminale C e proietta una lama di 36 domini transmembrana che si estende sia verso l'esterno che verso l'alto verso il terminale N. Sebbene siano disponibili solo strutture parziali di microscopia crioelettronica (crio-EM) di PIEZO1 prive di circa un terzo delle lame distali, l'omologo strutturale PIEZO2 è stato risolto con il complemento completo di domini transmembrana17. Nei modelli strutturali e nelle previsioni, le pale formano una forma a scodella di circa 24 nm di diametro e 9 nm di profondità, con un'area totale proiettata di circa 450 nm2. Le lame si collegano direttamente al poro tramite un raggio intracellulare, suggerendo che siano entrambe le leve che aprono direttamente il canale e i sensori primari della forza meccanica6.

a, Modelli strutturali di PIEZO1, visti extracellulari. Vengono mostrate la struttura crio-EM più completa di PIEZO1 con la parte distale mancante di circa un terzo della lama evidenziata (a sinistra) e la previsione della struttura AlphaFold II di PIEZO1 (a destra). Il dominio extracellulare C-terminale (CED) viene rimosso dal modello AlphaFold II a causa della scarsa previsione. I tag TCO*K nella posizione 103 sono mostrati come stelle magenta. Ogni protomero è colorato separatamente. b, Segmentazione delle particelle PIEZO1 candidate dalle localizzazioni iPALM. Un'immagine rappresentativa del contrasto di interferenza differenziale × 100 (da n = 5 celle) di una cellula HEK293 che esprime TCO * K 103 PIEZO1 etichettata con tetrazina-Alexa Fluor 647 (AF647) (in alto a sinistra; barra della scala, 10 µm). Un rendering di 3 nm per pixel delle localizzazioni della membrana plasmatica dall'inserto magenta in alto a sinistra (barra della scala, 3 µm) (in alto al centro). Localizzazioni AF647 binarie (punti magenta) con molecole PIEZO1 candidate che soddisfano i requisiti del vicino più vicino evidenziate con riquadri ciano (barra della scala, 3 µm) (in alto a destra). Vengono inoltre mostrati rendering rappresentativi di 3 nm per pixel di molecole PIEZO1 a tripla etichettatura candidate che soddisfano i requisiti minimi di separazione di interlocalizzazione (barre di scala, 30 nm) (in basso). c, Super-particella fusa di localizzazioni trimeriche PIEZO1 identificate con tripla promozione della simmetria, viste dall'alto verso il basso (n = 5 cellule immagine, n = 726 molecole e n = 8.500 localizzazioni). Le localizzazioni sono state visualizzate con dimensioni e colore proporzionali alla densità locale (vedi Metodi). d, Superparticella con soglia per una densità locale superiore a 0,5 × 10−5, il minimo che comprendeva localizzazioni all'interno di una sfera di 60 nm (a sinistra). Localizzazioni associate a ciascuna lama isolata con k significa clustering con k = 3 cluster (a destra). e, grafico a dispersione delle distanze interblade medie per localizzazione tra ciascuna localizzazione all'interno di un cluster di lame dalla superparticella nella parte c e tutte le localizzazioni in un cluster di lame vicino, colorato in base alla densità locale. Nella posizione 103, la distanza interlama più probabile è 25,4 ± 5,9 nm (media ± sd), rispetto a 19,2 nm calcolata dal modello AlphaFold II.